Характеристика роста бактерий вида klebsiella oxytoca на средах, используемых в дифференциально-диагностических целях

В мире достаточно распространенными являются заболевания, вызванные с условно-патогенными микроорганизмами, среди которых Klebsiella занимает ведущее место. В зависимости от состояния иммунной системы человека этот возбудитель может явиться причиной как легкого инфекционного заболевания, так и тяжелого септического проявления. Бактерии вида Klebsiella oxytoca представляют собой грамотрицательные факультативно-анаэробные бактерии. Оптимальными условиями культивирования являются температура роста (35–37) ˚С и время инкубирования (20–24) часа. Штаммы бактерий данного вида, как правило, индолоположительны (в связи с чем и были выделены в отдельный вид), отрицательны по аргининдигидролазе и орнитиндекарбоксилазе, обладают подвижностью при 10 ˚С. Непременной особенностью Klebsiella считают «пышный» и обильный рост с образованием на плотных питательных средах (среда Эндо, среда Плоскирева, среда Левина) больших, выпуклых, частично сливающихся колоний слизистой консистенции. При первичной идентификации бактериального агента применяют бактериологический метод и бактериоскопию. Бактериологический метод связан с посевом материала на питательные среды, позволяющие дифференцировать штаммы гетерогенных бактерий (анализируя характер выросших колоний). В практике наиболее часто используются среды Эндо, Левина, Плоскирева, ВСА. Стоит отметить, что рост на этих средах штаммов гетерогенных бактерий или бактерий, являющихся сопутствующей микрофлорой при выделении бактерий рода Klebsiella, имеет ряд отличий: бактерии рода Escherichia на среде Эндо образуют ярко-малиновые колонии с металлическим блеском (у Klebsiella лишь некоторые штаммы способны образовывать колонии с металлическим блеском, цвет колоний – малиновый); на среде Левина бактерии рода Escherichia образуют черно-синие колонии с металлическим блеском (у Klebsiella колонии сине-розового цвета); на среде Плоскирева бактерии рода Escherichia образуют по краям среды колонии серого цвета, в центре – розовые или брусничного цвета, с желтоватым оттенком (у Klebsiella колонии светло-красного цвета); бактерии рода Enterobacter на среде Эндо образуют нежно-розовые колонии (у Klebsiella колонии подобного цвета встречаются редко); на среде Левина рост бактерий рода Enterobacter, в отличие от рода Klebsiella, подавляется; на среде Плоскирева бактерии рода Enterobacter образуют колонии бежевого цвета или с явно выраженным бежевым оттенком (у Klebsiella колонии светло-красного цвета); бактерии рода Serratia на среде Эндо, Левина и Плоскирева образуют бесцветные, прозрачные (пигментообразующие штаммы – красные) колонии, причем хороший рост отмечается при 30 ˚С (у Klebsiella оптимальной температурой роста является (35–37) ˚С, колонии малинового цвета). Бактериоскопия заключается в окрашивании мазков по Граму. Цель исследований заключалась в изучении особенностей роста бактерий вида K. oxytoca на питательных средах, используемых для бактериологической идентификации и дифференциации. Материалы и методы В работе использовались 7 штаммов бактерий, выделенных нами из внешней среды и типированных как бактерии K. oxytoca, и 1 штамм, полученный из коллекции кафедры МВЭиВСЭ (Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина) – ATCC 8724. В качестве гетерогенных штаммов использовали бактерии семейства Enterobacteriaceae: E. coli 383, E. cloaceae 397, S. marcescens 21. Для изучения особенностей роста штаммов бактерий использовали среды, которые наиболее часто используются в практике: среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева. Посев на среды суточных культур осуществляли после «подращивания» на мясопептонном бульоне в течение 24-х часов. Суточную культуру каждого штамма высевали на отобранные питательные среды штрихом. Инкубировали посевы в течение 24-х часов при 37 ˚С. Результаты исследований Анализ роста бактерий на средах проводили по следующим критериям: величина колоний, форма колоний, характер контура края, рельеф колоний, цвет, консистенция. Характер роста бактериальных колоний дифференцировали: – слабый (диаметр выросших колоний едва достигает 1-го мм, количество колоний < 20; диаметр колоний < 0,5 мм, количество колоний > 50); – средний (диаметр выросших колоний (1–2) мм, количество – (20–50); диаметр – (2–3) мм, но количество колоний < 30); – обильный (диаметр выросших колоний (2–3) или (3–4) мм, количество > 50). Результаты проведенных исследований позволяют отметить хороший, обильный рост на среде Плоскирева у 62,5 % всех исследуемых штаммов (K. oxytoca 1, K. oxytoca 2, K. oxytoca 3, K. oxytoca 25, K. oxytoca АТСС 8724). Слизистые пышные колонии достигали диаметра 2–3 мм, цвет колоний варьировал от светло-розового до розового. Рост на среде Левина у 50,0 % штаммов (K. oxytoca 1, K. oxytoca 10, K. oxytoca 25, K. oxytoca АТСС 8724) средний, с сине-розовыми колониями в диаметре 1–2 мм. У 37,5 % штаммов (K. oxytoca 3, K. oxytoca 24, K. oxytoca 26) рост слабый, количество сине-розовых колоний достигало 20. На среде Эндо отмечен самый слабый рост бактерий, с образованием мелких и редких колоний с металлическим блеском. Отметим, что два штамма (K.oxytoca 24, K.oxytoca 26) образовывали лактозоотрицательные колонии. Бактерии K. oxytoca, E. cloaceae и S. marcescens согласно системе дифференциации, предложенной Э. Юингом и П. Эдварсом (объединение по сходству биохимических и культуральных признаков), относят к одной трибе – Klebsielleae. Бактерия E. coli является модельным микроорганизмом в микробиологических исследованиях (поскольку является одним из самых хорошо изученных микроорганизмов). Кроме того, E. coli является микроорганизмом, культуральные свойства которого схожи со многими энтеробактериями (в частности, Klebsiella), что приводит к значительным затруднениям при выделении бактерий. Сравнительный анализ эффективности использования сред в дифференциально-диагностических целях заключался в посеве гетерогенных штаммов и штаммов вида K. oxytoca на среду Плоскирева (наиболее благоприятная по составу питательная среда, на которой рост бактерий вида K. oxytoca отличается своим обилием и «пышным» ростом). Инкубация посевов производилась в условиях термостата при 37 ˚С, с наблюдением за изменениями в течении 2-х суток. Согласно результатам, отмечены сходные культуральные свойства бактерий K. oxytoca 1, K. oxytoca 24, E. cloacae 397, E. coli 383 – это образование выпуклых светло-розовых колоний правильной формы, с ровными краями и слизистой консистенцией. Рост S. marcenscens 21 отличается от данных видов характеристикой выросших колоний и образованием через 48 часов красного пигмента. 

В результате проведенных исследований обильный рост с образованием большого количества слизистых «пышных» колоний правильной формы отмечен на среде Плоскирева (62,5 % всех изучаемых штаммов K.oxytoca), формирование небольшого количества колоний (или большого количества, но мелких колоний) фиксируется на среде Эндо, на среде Левина рост бактерий можно охарактеризовать как средний – с образованием средней величины и небольшого количества колоний. Использование среды Плоскирева в исследованиях не обеспечивает прямой идентификации бактерий, в связи с чем необходимо выделение их в чистой культуре и последующая идентификация широким набором тестов, что длительно и трудоемко. Анализ полученных данных позволяет заключить о недостатках всех этих сред, т.к. на них помимо бактерий рода Klebsiella хорошо растут и другие бактерии семейства Enterobacteriaceae, что затрудняет отбор колоний для проведения дальнейшей идентификации. Для определения принадлежности культур к клебсиеллам необходима постановка целого ряда подтверждающих тестов (тесты на подвижность, сероводород, мочевину, фенилаланиндезаминазу, цитрат Симмонса, малонат, лизиндекарбоксилазу, инозит) и, следовательно, значительное время и материальные затраты. В целях ускорения исследования, значительного сокращения объема работы и материальных средств считаем эффективным разработку хромогенной питательной среды для одноэтапного выделения и прямой идентификации бактерий рода Klebsiella.  

ФГБОУ ВО «Ульяновский государственный агарный университет имени П. А. Столыпина»
Садртдинова Гузелия Рафиковна, ассистент
Актуальные вопросы ветеринарной биологии № 3 (35), 2017