ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ В ФАРМАКОПЕЙНОМ АНАЛИЗЕ: ПРИМЕНЕНИЕ, ДЕЙСТВУЮЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ, ВОПРОСЫ СТАНДАРТИЗАЦИИ

Питательные среды (ПС) — однокомпонентные или многокомпонентные субстраты, широко применяемые в различных отраслях науки и производства для культивирования и изучения микроорганизмов или культур клеток высших организмов. Их используют в санитарной и клинической микробиологии для диагностики заболеваний и изучения объектов окружающей среды, в пищевой и фармацевтической промышленности при производстве и контроле качества продукции, в криминалистике. В последние годы в связи с расширением спектра производства, прежде всего, сложных биологических лекарственных препаратов (БЛП), к которым относятся иммунобиологические, биотехнологические и генотерапевтические лекарственные препараты, значимость ПС существенно возросла. Выпуск БЛП невозможен без использования ПС как в процессе производства, так и при оценке качества. Качество этих «критических реагентов» , обеспечивает и определяет качество лекарственных препаратов. Учитывая, что приоритетом государственного регулирования является безопасность, качество и эффективность лекарственных средств (ЛС) , использование при производстве отвечающих соответствующим требованиям ПС является актуальной задачей.

Цель работы — изучение требований к питательным средам, используемым при производстве лекарственных средств, для определения направлений разработки национального стандарта. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 
1. Изучить нормативную базу, определяющую в Российской Федерации требования к ПС различного назначения.
2. Провести анализ требований фармакопеи Российской Федерации и ведущих зарубежных фармакопей к ПС, используемым при производстве ЛС.
3. Определить направления разработки и стандартизации национальных требований к ПС, используемым при производстве ЛС.

До введения в действие XII изд. Государственной фармакопеи Российской Федерации (ГФ РФ) ПС для контроля микробной загрязненности (так называемые «номерные среды» — № 1–15), а также другие ПС различного целевого назначения, относившиеся к иммунобиологическим лекарственным препаратам, в том числе и для контроля стерильности ЛС, проходили государственную регистрацию с утверждением на них фармакопейного стандарта: фармакопейной статьи (ФС) и/или фармакопейной статьи предприятия (ФСП). ФС традиционно включала перечень показателей, нормативные требования, а также подробное описание методов контроля качества соответствующей ПС3 . На сегодняшний день ПС не включаются в Государственный реестр ЛС и не имеют действующих государственных стандартов качества ,а нормативно-правовое регулирование производства и применения ПС осуществляется в соответствии с их назначением. Подтверждение соответствия микробиологических ПС, основ питательных и сырья биологического для вирусологических ПС, применяемых в медицине, осуществляется в форме принятия декларации о соответствии . При принятии декларации о соответствии производитель (заявитель) на добровольной основе подтверждает соблюдение требований нормативной документации. Государственной регистрации в качестве медицинского изделия подлежат среды, предназначенные исключительно для диагностики инфекционных заболеваний . Требования к медицинским изделиям для диагностики ин витро регулируются ГОСТ Р 51088-20137 , ГОСТ Р 51352-20138 , ГОСТ Р ЕН 12322-20109 .
Для обеспечения качества результатов исследований необходимо применение стандартных ПС, реагентов и использование стандартных методик проведения и учета результатов. Однако стандарты, использование которых позволило бы производителю подтвердить соответствие своего изделия конкретным требованиям безопасности, эффективности и качества, в данных документах отсутствуют. ПС, используемые в иных целях, в том числе для научных и санитарно-эпидемиологических исследований, для микробиологического контроля образцов пищевых продуктов, кормов животных, фармацевтических и косметических продуктов, образцов окружающей среды, государственной регистрации в качестве медицинских изделий не подлежат. Для работников организаций, осуществляющих изготовление ПС при серийном промышленном выпуске, а также для микробиологических лабораторий, распространяющих или изготавливающих ПС для микробиологии для собственного использования, контроль качества осуществляется согласно МУК 4.2.2316-0810, для микробиологических лабораторий пищевой промышленности — согласно ГОСТ ISO 11133-201611.
Наиболее полно на сегодняшний день требования к качеству и методам контроля бактериологических ПС в зависимости от их назначения изложены в МУК 4.2.2316-08, а именно, их классификация и полный перечень показателей качества, включающий физико-химические показатели, а также специфическая активность (чувствительность среды, дифференцирующие, ингибирующие свойства, эффективность среды, показатель прорастания и др.). Приведена техника приготовления сред, контроля их чистоты, условия хранения, наименование тест-штаммов, необходимых для оценки специфической активности, а также условия инкубации посевов. Тем не менее, учитывая современные тенденции, направленные на повышение требований к производству и качеству ЛС, данный документ также не представляется исчерпывающим для соответствующего применения. Основные стандарты, предназначенные для оценки качества ЛС, включая требования к используемым в целях проведения анализа реагентам и материалам, в нашей стране регламентируются ГФ РФ12. В XIV изд. ГФ РФ включены общие ФС (ОФС) на реактивы, титрованные и буферные растворы, однако аналогичный отечественный стандарт на ПС до настоящего времени не введен в практику фармакопейного анализа.

Необходимо отметить, что в ОФС 1.3.0001.15 Реактивы. Индикаторы приводятся сведения об отдельных реактивах и индикаторах (глюкоза, натрия хлорид, динатрия фосфат, феноловый красный, фуксин основной), которые могут выступать в качестве вспомогательных компонентов ПС. Однако ПС в отличие от химических реактивов имеют, как правило, более сложный состав, поскольку содержат в качестве основы неоднородное по своим свойствам, характеризующееся высокой степенью вариабельности биологическое сырье, качество которого главным образом обеспечивает качество самой среды [3]. В связи с этим для установления требований к качеству ПС, используемых не только для производства, но и для оценки качества лекарственных препаратов, этой информации, безусловно, недостаточно. Общий анализ статей ГФ РФ XIV изд. подтверждает, что ПС различного назначения находят свое применение как на подготовительных этапах, так и в процессе производства ЛС и оценки их качества. Использование ПС различного назначения предусмотрено требованиями более 30 ОФС на методы анализа и группы препаратов, а также практически всеми ФС, предусматривающими оценку стерильности или микробиологической чистоты готового ЛС. Обобщение и систематизация данных ГФ РФ XIV изд. по целевому назначению ПС, используемых для выпуска ЛС, позволяет условно разделить их на две основные группы: производственные и непроизводственные.

Дальнейший критический анализ статей ГФ РФ XIV изд. показал, что приводимая информация, касающаяся общих сведений в отношении выбора и подготовки ПС различного назначения, как правило, ограничивается требованием к использованию оптимальной/адекватной среды и/или к приготовлению ее в соответствии с приведенной в фармакопее рецептурой, а при использовании коммерческих сред — в соответствии с инструкцией производителя. Установлено, что подходы к изложению и объему приводимой информации, требованию к составу и оценке пригодности, условиям и срокам хранения, режиму стерилизации и объему выборки при проверке стерильности ПС могут значительно различаться и не всегда соответствовать руководящим документам по ПС14. Наличие такого рода разночтений может приводить к затруднениям при воспроизведении методик, а также стать причиной признания испытания недостоверным. Необходимо отметить, что наиболее полно в ГФ РФ XIV изд. описаны требования к средам, применяемым для анализа чистоты ЛС по показателям «Стерильность» и «Микробиологическая чистота», однако и в этих документах прописи ПС, способы приготовления и условия контроля их специфических свойств описаны с различной степенью детализации, иногда с взаимоисключающими рекомендациями.  Сходная ситуация наблюдается и в отношении изложения требований в ОФС к условиям и срокам хранения ПС. Приготовленные в лаборатории среды, предназначенные для оценки качества ЛС по показателю «Стерильность», могут храниться при температуре «от 2 до 25 °C в защищенном от света месте в течение 1 месяца или иного валидированного срока». При этом аналогичные ПС лабораторного изготовления, предназначенные для оценки качества ЛС по показателю «Микробиологическая чистота», следует хранить при комнатной температуре (т. е. от 15 до 25 °C) до окончания срока годности или 3 месяца при температуре 2–8 °C. Помимо этого требования к оценке пригодности и хранению ПС, предназначенных для испытания БЛП, содержащих живые микроорганизмы, по показателю «Микробиологическая чистота» не приводятся, а условия инкубации (32,5 ± 2,5) °C при оценке ростовых свойств (МПА, агар Эндо) отличаются от условий инкубации (37 ± 1) °C при проведении испытаний, что противоречит рекомендациям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) инкубировать среды при той же температуре, при которой проводятся испытания. Различные режимы инкубации рекомендованы также и для контроля стерильности приготовленных в лабораториях ПС. Сравнительный анализ требований девяти ведущих зарубежных фармакопей: Республики Беларусь (БФ), Казахстан (КФ), Украины (ГФУ), Индии (ИФ), Великобритании (БрФ), Японии (ЯФ), США (ФСША), а также Международной (МФ) и Европейской фармакопей (ЕФ) к ПС, используемым при производстве ЛС, показал, что ведущие фармакопеи мира, в том числе стран-членов ЕАЭС, также не имеют фармакопейного стандарта на ПС. Исключение составляет ФСША, в которой требования к ПС, предназначенным для оценки качества ЛС, обобщены и представлены в соответствующей монографии. Документ включает как общие рекомендации по подготовке ПС к использованию (выбор надлежащих ПС, компонентов, воды; соблюдение инструкций по приготовлению и рекомендации по взвешиванию, растворению, стерилизации, используемой посуде, измерению рН, проверке емкостей перед испытанием), так и требования к оценке их качества (определение рН и ростовых свойств, периодическая проверка стабильности качества для подтверждения срока годности), к хранению и утилизации, а также к контролю красителей для идентификации микроорганизмов. В фармакопеях других стран также наибольшее внимание уделяется ПС, предназначенным для анализа качества ЛС, и, в первую очередь их чистоты, поэтому требования к составу ПС, порядку контроля и условиям его выполнения приводятся в монографиях, посвященных биологическим испытаниям. В соответствии с назначением ПС определяются подходы к оценке их пригодности. Основным критерием пригодности сред для анализа чистоты ЛС служит наличие роста соответствующих тест-штаммов после внесения не более 100 КОЕ и инкубации не более 5 суток, подтверждающего способность среды к выявлению искомых микроорганизмов. Для некоторых установленных требований допускается возможность отступления от четкой регламентации. В частности, разрешено использование тест-штаммов других коллекций, типичных по своим свойствам, других условий стерилизации, сроков хранения, объема выборки при условии валидации процедуры. Возможно изменение концентрации некоторых ингредиентов, особенно биологического происхождения, в связи с тем, что их качество может быть различным. Вместе с тем, результаты сравнительного анализа требований к тиогликолевой среде, рекомендованной всеми фармакопеями для оценки качества ЛС по показателю «Стерильность» свидетельствуют, что даже при практически одинаковом составе среды базовые рекомендации (режим стерилизации, тест-штаммы для оценки ростовых свойств, условия инкубации и хранения) в фармакопеях различных стран также могут существенно отличаться. С различной степенью детализации приводится фармакопеями порядок приготовления этой среды, включающий необходимость проведения процедуры фильтрования, соблюдения соотношения площади поверхности среды к ее глубине при выборе емкости, а также проверки ее пригодности в отношении сохранения анаэробных условий. Например, в ГФ РФ XIV изд. требование по соблюдению соотношения площади поверхности среды к ее глубине не рассматривается в связи с тем, что в качестве емкостей рассматривается использование только пробирок, чем обеспечивается необходимое соотношение. Такое ограничение при выборе емкостей, на наш взгляд, нецелесообразно из-за высокой трудоемкости процедуры посева, а также невозможности ее выполнения в соответствии с требованиями ОФС 1.2.4.0003. Стерильность по минимальному количеству испытуемого препарата, необходимого для посева на ПС при исследовании образцов препаратов, выпускаемых большими сериями и/или в больших емкостях. В отношении выбора режима стерилизации большинство стран на сегодняшний день сходится во мнении о необходимости валидации данной процедуры в связи с тем, что ее эффективность, а также ростовые свойства простерилизованной среды, зависят от различных факторов, в том числе и от объема стерилизуемых жидкостей. Только в ГФ РФ XIV изд. и ИФ приводятся конкретные, при этом различные, режимы стерилизации одной и той же среды: 121 °C 15 мин и 121 °C 20 мин, соответственно, при этом допускается использовать также и другие режимы, если они приведены в нормативной документации. То есть, по сути, это является прямым указанием на необходимость проведения валидации. Срок и условия хранения тиогликолевой среды большинством фармакопей также не указываются в связи с тем, что требования должны устанавливаться на основании результатов процедуры валидации. В качестве исключения можно привести наличие данной информации в ОФС 1.2.4.0003.15 Стерильность и в монографии ИФ. Перечень основных штаммов, необходимых для оценки ростовых свойств тиогликолевой среды, в рассматриваемых фармакопеях преимущественно одинаковый. Однако в России он расширен, с одной стороны, для возможности проведения испытания иммунобиологических лекарственных препаратов с помощью одной универсальной среды, а с другой — для сохранения национальных стандартов при проведении испытаний других ЛС. Возможность использования одной тиогликолевой среды для оценки качества препаратов с ртутьсодержащими консервантами в составе, которые не могут быть проконтролированы с помощью метода мембранной фильтрации, предусмотрена также требованиями ЕФ, ФСША, МФ, БФ, при условии подтверждения в валидационных испытаниях ее способности поддерживать рост аэробных и анаэробных бактерий и грибов, засеянных в количестве не более 100 КОЕ. Согласно материалам ГФ РФ, ИФ, ФСША допускается изменение количества и наименования типичных по культурально-морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам тест-штаммов, необходимых для оценки ростовых свойств тиогликолевой среды. Набор тест-штаммов может быть изменен также в зависимости от способа применения или состава испытуемого препарата, что представляется нам наиболее подходящим решением. Такой подход согласуется с рекомендациями ВОЗ24, а также МФ25, по возможности выбора разнообразных аэробных, анаэробных тест-штаммов бактерий и грибов, включая такие их виды, которые обнаруживаются в среде производственных помещений. Несмотря на наличие во всех фармакопеях требования проверки на стерильность и ростовые свойства используемой среды, предмет проверки (серия, партия) и очередность проведения оценки качества (до или во время испытания) также могут не всегда однозначно трактоваться. Объем выборки для проведения испытания на стерильность самой среды указывается только в ГФ РФ XIV изд. При этом количество емкостей, необходимое для проведения испытания (не менее 5 %), превышает нормы выборок для испытания образцов ЛС на стерильность (2 %), а также для проверки готовых к применению сред и не соответствует требованиям ОФС 1.4.0004.15 Отбор проб. Анализ требований различных фармакопей, предъявляемых к ПС, на примере только тиогликолевой среды в рамках испытания ЛС на стерильность, выявил наличие многочисленных расхождений, касающихся как подготовки к испытанию, оценке качества, так и к условиям и срокам хранения среды. Для расширения возможностей испытания рядом фармакопей допускаются отклонения от жесткой регламентации процедуры, при сохранении принципа испытания, в связи с тем, что излишняя детализация и конкретизация процедур могут существенно ограничивать возможности испытания, особенно сложных высокотехнологичных ЛС, приводя при несоблюдении фармакопейных требований к признанию испытания недействительным. Изучение данных по ПС другого назначения позволило установить, что требования к качеству вспомогательных ПС в ГФ РФ XIV изд. и в рассматриваемых зарубежных фармакопеях ограничиваются общими положениями об их адекватности, использовании соответствующих методов посева и условий инкубации. Для полноценной эффективной работы с данной группой сред, обеспечивающих сохранение и стабильность свойств посевного материала и тест-штаммов, используемых при производстве и контроле ЛС, также необходимо формирование надлежащих требований. Определяющими факторами для формирования требований российской и зарубежных фармакопей к качеству производственных ПС, как правило, являются вопросы, связанные с безопасностью готового продукта. Требования к качеству производственных ПС в ГФ РФ XIV изд. представлены с учетом современных подходов к оценке наиболее актуальных рисков. Как и в ЕФ, в ГФ РФ XIV изд. установлены особые ограничения, предъявляемые к ряду компонентов ПС, используемых в производстве БЛП, которые не должны содержать ингредиентов, вызывающих токсические, аллергические или другие нежелательные реакции у людей, а при использовании таких компонентов следует продемонстрировать, что их количество в конечном продукте ниже уровня, гарантирующего безопасность для человека.

Отмечается, что при оценке рисков особое внимание должно уделяться риску, связанному с контаминацией губчатой энцефалопатией животных и латентными вирусами. Согласно требованиям ГФ РФ XIV изд. одним из условий, обеспечивающим качество БЛП, является использование «адекватных» ПС, обладающих высокими ростовыми свойствами (сырье и реагенты, используемые при производстве ПС, должны иметь сертификаты, подтверждающие их качество). Не вызывает сомнения тот факт, что при выборе ПС для производства ЛС под «высокими ростовыми свойствами» должна подразумеваться не традиционная способность к выявлению контаминации, а требования к уровню соответствующей продуктивности и/или эффективности. В ЕФ отмечается необходимость учета рисков при использовании для производства вакцин ПС, содержащих компоненты животного происхождения. По согласованию с уполномоченным органом в ПС для выращивания клеток допускается использование сыворотки крови животных, но среда, используемая для поддержания роста клеток при размножении вируса, не должна содержать сыворотку крови, если не указано иначе в частной статье. Предпочтительно, чтобы среды, используемые в процессе производства, также не содержали антибиотиков. Обобщение данных фармакопей разных стран и современных требований, предъявляемых к производству ЛС, позволяет сделать вывод о том, что в качестве основного подхода при оценке качества ПС рассматривается важность соблюдения принципа управления рисками для качества. Надлежащая производственная практика напрямую связана с необходимостью проведения валидации, т. е. документированного подтверждения соответствия установленным требованиям и характеристикам качества всех процессов и методик применительно к конкретному производству и выпускаемой продукции, включая требования к качеству ПС. С целью доказательства пригодности ПС для оценки качества должны подтверждаться их ростовые свойства, методика испытания должна быть валидирована для каждой ПС и ЛС.

При использовании эффективных сред в процессе производства (производственные среды) особое внимание должно быть уделено возможному риску контаминации конечного продукта. Анализ действующей нормативной базы в части требований, предъявляемых к ПС, свидетельствует о целесообразности и необходимости разработки национального фармакопейного стандарта, в котором, принимая во внимание современные тенденции, направленные на унификацию международных требований, предъявляемых к качеству ЛС и повышению уровня фармакопейного анализа, следует отразить основные критерии и требования к качеству различных по назначению групп ПС, используемых при производстве и контроле ЛС. Решение поставленной задачи должно заключаться не столько в конкретизации и/или детализации требований к ПС, сколько в создании системного дифференцированного подхода к оценке качества сред различного назначения, включающего возможные от использования ПС риски, влияющие на качество ЛС.

Выводы
1. Анализ нормативной базы, определяющей требования к питательным средам в Российской Федерации, показал, что государственные стандарты, регламентирующие требования к питательным средам, используемым при производстве лекарственных средств, отсутствуют.

2. Установлено, что в России и за рубежом наиболее полно фармакопейные требования изложены к питательным средам, используемым для анализа чистоты лекарственных средств. Перечень требований, включающий подготовку питательной среды, оценку качества и условия хранения, а также подходы к их установлению и изложению, различны. 3. Обоснована целесообразность и определены основные направления разработки и стандартизации требований к качеству различных групп питательных сред, используемых при производстве и контроле лекарственных средств, для подготовки ОФС Питательные среды в Государственной фармакопее Российской Федерации.

Суханова Светлана Михайловна, канд. биол. наук.
Захарова Наталия Евгеньевна, канд. биол. наук.

Источник: БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2019, Т. 19, № 3