Статьи

Нelicobacter pylori – одна из самых распространенных в мире. Для диагностики хеликобактериоза разработано множество методов, одним из которых является бактериологическое исследование. Трудоемкость и сложность выделения H. pylori ограничивает применение этого метода в рутинной практике практического здравоохранения, но он остается единственным для фенотипического определения чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам. Мониторинг за растущей резистентностью H.pylori, коррекция схем эрадикационной терапии с учетом чувствительности выделенных штаммов к химиотерапевтическим препаратам, испытания новых лекарственных препаратов делают бактериологический метод незаменимым для практических и научных целей.

Условия роста и физиологические особенности H. pylori

H. pylori – микроаэрофилы (оптимальная концентрация кислорода – 3-15%) и капнофилы (оптимальная концентрация углекислого газа – 10-15%). Xia H. и соавт. (1994) получили культуру H. pylori, выросшую в аэробных условиях, но она отличалась меньшим размером колоний и низкой частотой деления микробных клеток. Это противоречие можно объяснить феноменом: при низкой концентрации бактериальной популяции H. pylori являются микроаэрофилами, а при высокой могут расти в аэробных условиях. H. pylori требовательны к питательным средам, в составе которых необходимо присутствие крови или сыворотки. На кровяном агаре дают рост через 2-5 суток в виде мелких (диаметром 1-2 мм), влажных, прозрачных колоний. Некоторые штаммы проявляют гемолитическую активность (α-гемолиз). Оптимальная температура роста составляет 37°С, но некоторые штаммы могут расти при +30°С и +42°С. Оптимальное значение pH – нейтральное, ближе к слабощелочному (8,5). H. pylori нуждаются в ряде готовых аминокислот, в частности в аргинине, гистидине, изолейцине, лейцине, метионине, фенилаланине, валине и серине, выступающих в качестве факторов роста и размножения. Они используют эти аминокислоты не только для синтеза белков, но и как основной источник энергии.

Культивирование на плотных и жидких средах

Культивирование H. pylori можно осуществлять как на твердых, так и на жидких средах, но в связи с трудностью выделения этих бактерий на жидких средах на практике используют агары (Шоколадный агар с факторами роста). Для культивирования H. pylori пред­ложены различные среды, которые можно разделить условно на селективные и неселективные.

В настоящее время для выделения H. pylori рекомендована комбинация неселективной и селективной сред или двух селективных. Обязательными компонентами сред являются базовый агар, ростовые добавки, а для селективных – ингибиторы роста сопутствующей микрофлоры (ванкомицин для ингибирования роста грамположительных кокков; полимиксин, налидиксовая кислота, колистин, триметоприм, цефсулодин для ингибирования роста грамотрицательных бактерий; нистатин, амфотерицин В для торможения роста грибов). H. pylori – очень прихотливый микроорганизм, требующий дополнительных факторов (витаминов, микроэлементов), усиливающих рост. Обязательным компонентом среды должна быть добавка 5-10% крови или сыворотки животных (бараньей крови). Использование крови человека ограничено наличием у большинства взрослого населения защитных антител, способных ингибировать рост H. pylori. При этом эритроциты могут быть лизированы, чтобы ростовые вещества могли быть использованы быстрее, что достигается при применении «шоколадного агара» (лизис эритроцитов происходит при нагревании крови, в связи с чем она приобретает шоколадный цвет). Предложены другие ростовые добавки: яичный желток, уголь, крахмал, альбумин бычьей сыворотки, циклодекстрин. Cellini L. и соавт. (1992) разработали среду с добавлением 2% изовиталекса и гемина (10 мг/л). Другая добавка – 2,3,5-трифенилтетразолинхлорид – способствует быстрой идентификации колоний H. pylori. В результате метаболического использования этого вещества бактерией оно превращается в нерастворимый формазан, и колонии H. pylori окрашиваются в золотистый цвет. Jiang X. и соавт. (2000) в качестве ростовых добавок предложили использование сульфата железа, пирувата натрия и свиного муцина. Для выделения H. pylori предложены дифференциально-диагностические среды, содержащие мочевину и индикатор.

 Сходный с плотными средами состав (основы, ростовые и селективные добавки), условия культивирования H. pylori, используются и в жидких средах, хотя этот процесс более трудоемок и в практических лабораториях не нашел широкого применения. Но способ культивирования H. pylori на жидких питательных средах незаменим в научных целях для изучения физиологии, метаболизма, экспрессии генов, кодирующих факторы патогенности. Его используют преимущественно при необходимости получения больших количеств микробной массы при субкультивировании для изучения ферментов, экзо- и эндотоксинов. Предложены различные основы жидких сред: Brucella-бульон, сердечно-мозговой бульон, соевый бульон с ростовыми добавками (сыворотка, дрожжевой экстракт, циклодекстрин и другие) и антимикробными препаратами (ванкомицин, налидиксовая кислота, амфотерицин В). Предложена среда, имеющая постоянный состав витаминов и микроэлементов без добавления сыворотки – serum-free Ham’s F-12. При росте на жидких питательных средах бактерии имеют типичную извитую форму, подвижны и биохимически активны, полноценны в антигенном отношении.

Преимущества использования готовых питательных сред

Культивирование H.pylori на готовой питательной среде «Шоколадный агар с факторами роста» имеет ряд преимуществ:

1) отсутствие необходимости использования дополнительного оборудования для поддержания микроаэрофильных условий в жидкой фазе среды;

2) использование стандартных питательных сред (Колумбийский агар с бараньей кровью,  агар Шедлера с бараньей кровью);

3) накопление чистой культуры H.pylori в количестве, достаточном для морфологической, биохимической идентификации и определения антибиотикограммы.